LAPORAN ISOLASI DNA KASAR

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
“ISOLASI DNA KASAR”

 

 

Oleh     :

Nama               : Burhan Setia Budi
NIM                 : 115040200111052
Kelompok        : Kamis, 09.15 WIB
Asisten             : Muhammad Arif

 

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012


 

BAB I
PENDAHULUAN

1.1.LATAR BELAKANG

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNAmitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskansifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisansifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuahsel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruhsistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimilikisuatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah.Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimanaterdapat DNA didalamnya.

Pentingnya pengetahuan tentang DNA dan cara mengisolasinya ini akan dibahas  dibahas tentang cara untuk mengisolasi DNA kasar dengan menggunakan alat dan bahan yang sederhana.

 

1.2.TUJUAN

-          Mengetahui definisi isolasi DNA

-          Mengetahui metode dan tahapan dalam isolasi DNA

-          Mengetahui manfaat isolasi DNA

 

 

1.3.MANFAAT

-          Mahsiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.

 

 

 

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

 

2.1. DEFINISI ISOLASI DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.

(Arsis, 2010)

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak.

(Yuwono, 2006)

DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis. Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya.

(Doyle, 1990)

DNA isolation is one of the most basic and essential techniques in the study of DNA. The extraction of DNA from cells and its purification are of primary importance to the field of biotechnology and forensics. Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling dasar dan penting dalam studi DNA. Ekstraksi DNA dari sel dan pemurnian yang merupakan kepentingan utama untuk bidang bioteknologi dan forensik.

(Purwantara, A. 2001)

 

 

2.2. MACAM METODE ISOLASI DNA

a. Kitchen Preparation

ada 4 hal penting yang harus kita lakukan untuk melakukan isolasi DNA yaitu:

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. pemecahan dinding sel.
3. pemecahan membran sel.
4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara fisik dengan menumbuk atau menggerus bahana yang akan kita gunakan. bahkan bahan yang lunak seperti strowberry cukup hanya diremas-remas saja.

Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA)bisa keluar.

Jika perlu kita dapat menambahkan proteinase (enzim pengurai protein) untuk menyingkirkan protein yang mungkin akan mengotori bahan yang kita inginkan. Proteinase alami yang dapat kita gunakan adalah papain yang merupakan ekstrak daun pepaya, atau bromelin yang merupakan ekstrak buah nanas.

 

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan.

(Tohib, 2012)

 

b. CTAB

CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat (Kaidah dan Suprapto, 2003), merusak membran sel dan melarutkan DNA ( Purwantara, 2001). Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.

Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996). Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein (Milligan, 1992). Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel.

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA (Ningrum, 2008). Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi (Purwantara, 2001). Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.

Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Sudarsono, 1996).

Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit ( Ningrum, 2008). Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Wyatt and Brown, 1996).

 

 

 

 

 

2.3. PERBEDAAN ISOLASI DNA KASAR DENGAN ISOLASI DNA BUFFER EKSTRAKSI

Isolasi DNA kasar (Kitchen Preparation)

Isolasi DNA halus dengan buffer ekstraksi (CTAB)

memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA dengan  megunakan deterjen dan garam dapur

Memecahkan dinding sel dan membran sel dengan detergen modifikasi CTAB dan mercaptoetanol

Tidak ada pemanasan pada proses ini

Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol

Tidak ada pengendapan komponen polisakarida

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA

Tidak ada penambahan buffer TE

Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak

Di ambil larutan supernatan yang bercampur dengan kontaminaan lainnya

Supernatan yang diambil kontaminannya sangat sedikit

ekstraksi DNA dengan kitchen preparation akan menghasilkan DNA kasar yang menggumpal dan belum murni (masih banyak zat lain yang terkandung)

ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility)

(Yuwono, 2006)

2.4. MANFAAT ISOLASI DNA

Ada manfaat  dari isolasi DNA, antara lain:

  1. Mendapatkan DNA murni yang akan digunakan dalam percobaan laboratorium tertentu.
  2. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
  3. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern
  4. Isolasi DNA genomik dalam rangka  pembuatan pustaka genomik.
  5. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,
  6. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

(Arsis, 2010)

 


 

BAB III
METODOLOGI

 

3.1. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
Cutter                     : mengupas dan memotong mangga
Mortar dan pestile  : menghaluskan buah mangga
Spatula                   : mengambil bubur mangga dan menggaduk laruran
Baker glass                        : menampung larutan
Gelas ukur             : mengukur volume larutan
Timbangan analytic           : menimbang bahan yang akan dipakai
Pipet                      : mengambil larutan

b. Bahan
Buah mangga         : bahan yang akan di isolasi DNAnya
Detergen
Rinso bubuk          : melisis sel
Rinso cair              : melisis sel
BuCream               : melisis sel
Aquadest               : pelarut
Garam                    : mengendapkan kotoran
Ethanol dingin       : menggumpalkan DNA

 

 

3.2. LANGKAH KERJA

 

Menyiapkan alat dan bahan

 

 
   

 

Mengupas mangga dan di ambil daging buahnya 5 gram
sample sebanyak 3

 

 
   

 

Daging mangga dihaluskan

Di masukkan dalam baker glass dan di tambah detergen
(masing-masing sample 2,5 garm dengan detergen yang berbeda)

 

 
   

 

Diaduk dan di biarkan selama 10 menit

                                                  

Larutan yang di tengah di ambil sebanyak 5 ml

 

 
   

 

Di masukkan dalam tabung gelas

 

 
   

 

Ditambah dengan ethanol dingin 5 mL

 

 
   

 

Diamati penggumpalan DNA

 

 
   

 

Hasil dan dokumentasi

 

3.3. ANALISA PERLAKUAN

            Langkah pertama yang dilakukan adalah mengupas buah mangga dan diambil daging buahnya sebanyak 5 gram utuk setiap sample. Di gunakan 3 sample dengan masing-masing bahan untuk melisis sel yang berbeda yaitu sample pertama menggunakan Rinso cair, sample kedua menggunakan Rinso bubuk, dan sample yang ketiga menggunakan BuCream. Daging mangga di haluskan dengan menggunakan mortar dan pestile. Setelah halus di masukkan ke dalam beaker glass dan di tambah detergen 2,5 gram dan garam sebanyak 2,5 gram. Di larutkan dengan menggunakan aquadest sebanyak 50 ml. Di aduk sampai semuanya tercampur merata. Di diamkan selama 10 menit supaya larutan menggendap. Setelah 10 menit larutan di ambil supernatannya sebanyak 5 ml, dan dimasukkan ke dalam gelas reaksi. Kemudian ditambah dengan ethanol dingin sebanyak 0,6 ml. Diamati penggumpalan DNAnya dan didokumentasikan.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

 

4.1. HASIL

 

 

Gambar larutan setelah bahan dicampurkan (buah mangga, detergen, garam, dan aquadest)

 

 

Gambar setelah larutan diambil supernatan dan ditambah dengan ethanol dingin

 

 

Gambar sample dengan menggunakan detergen cair

 

 

Gambar sample dengan menggunakan detergen bubuk

 

 

Gambar sample dengan menggunakan detergen cream

 

 

4.2. PEMBAHASAN

      Dari hasil praktikum mengenai isolasi DNA kasar didapatkan data gambar seperti diatas. Pada sample pertama yang menggunakan detergen cair cairan berwaarna bening kebiruan dengan penampakan gumpalan DNA yang sangat sedikit. Terdapat bintik-bintik putih seperti jentik yang menyebar dilarutan, itulah yang dimaksud gumpalan DNA. Jumlahnya hanya sedikit dan tersebar di seluruh larutan.

      Pada sample kedua yaitu menggunakan detergen bubuk (Rinso Bubuk), di dapatkan hasil larutan yang berwarna coklat muda kebiruan. Pada larutan tersebut terdapat bintik memanjang berwarna putih. Gumpalan DNA lebih panjang dan lebih jelas terlihat. Tersebar di seluruh larutan dengan jumlah yang banyak.
      Pada sample ketiga yang menggunakan detergen cream (BuCream) didapatkan larutan berwarna biru muda agak keruh. Pada larutan terdapat gumpalan DNA yang agak jelas dan jumlah yang agak banyak.

      Kesimpulannya adalah jumlah gumpalan DNA terlihat paling banyak di sample yang menggunakan detergen bubuk, selanjutnya adalah yang menggunakan detergen cream (BuCream), dan yang paling sedikit adalah yang menggunakan detergen cair (RinsoCair).

Menurut Jamilah (2005: 95) diantara detergen bubuk, detergen Rinso menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan konsentrasi air tinggi.

Sedangkan untuk mengetahui fungsi detergen dalam isolasi DNA ini menurut (Jamilah, 2005: 11) dalam proses isolasi DNA, detergen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler yang dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa “memakan” DNA).

Selain lisozim dan EDTA, bisa juga digunakan detergen seperti sodium dodesil sulfat (SDS) karena detergen ini bisa menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel, sehingga bisa meusak struktur membran sel (Tim Dosen Biologi FMIPA UB, tanpa tahun: 19-20). Anonim (tanpa tahun, dalam Jamilah, 2005: 11) menyatakan bahwa detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel engan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat. Dollard (2005, dalam Jamilah, 2005: 11) menambahkan bahwa detergen ini kemudian membentuk kompleks dengam lipid dan protein dan menyebabkannya terpresipitasi ke dalam larutan.

Zubaidah (2004: 38) menambahkan bahwa padasaat penghancuran jaringan sampel pada awal proses isolasi DNA, terjadi pelepasan senyawa polifenol dan polisakarida. Senyawa polifenol yang teroksidasi akan mengadakan ikatan kovalen dengan DNA yang membentuk suatu senyawa kompleks berwarna kecokelatan, sedangkan polisakarida mengalami kompresipitasi dengan asam nukleat saat presipitasi dengan penambahan alkohol sehingga terbentuk suatu matriks seperti lem dalam jumlah berlebihan. Hal ini dapat menyebabkan DNA menjadi kental, sulit larut secara sempurna dan sulit di pipet meskipun telah dilarutkan dalam buffer TE. Akan tetapi jika ditinjau dari sudut pandang media, DNA yang baik adalah DNA yang serupa pintalan benang.

Ditinjau dari faktor penambahan garam ke dalam larutan detergen pada proses isolasi DNA, garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994, dalam Jamilah, 2005: 21). Dari pernyataan tersebut, nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA.

Konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain: keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu ethanol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. (Jamilah, 2005: 21).

Menurut  (Jamilah, 2005: 21-22) pada saat penambahan ethanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada di bagian dasar tabung karena ethanol memiliki densitas (kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air. DNA akan tampak nyata sebagai strands (unting) putih atau suatu bahan yang kental dengan gelembung udara yang terperangkap di dalamnya. Gelembung ini yang akan menyebabkan DNA naik ke bagian atas larutan.

Ditinjau dari jenis buah yang digunakan sebagai sumber DNA, buah yang memiliki kadar air rendah menghasilkan presipitasi DNA yang lebih baik daripadabuah yang kadar airnya tinggi Kecepatan pembentukan DNA juga dipengaruhi oleh jenis detergen yang digunakan, dalam hal ini detergen cair (Rinso cair) memiliki kualitas kurang baik dalam pembentukan DNA pada ekstrak buah. Ini karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain.

 

BAB V
PENUTUP

 

 

5.1. KESIMPULAN

Dari hasil praktikum didapatkan data sebagai berikut        :
      Dari ketiga sample yang digunakan ( detergen cair, detergen bubuk, dan detergen cream), DNA yang paling banyak terlihat adalah pada sample yang menggunakan detergen bubuk, setelah itu detergen cream, dan yang paling sedikit adalah yang menggunakan detergen cair.
      Detergen pada isolasi DNA ini berfungsi untuk melisis dinding sel, dan garam untuk mengendapkan kotoran yang terbawa, sedangkan ethanol dingin berfungsi untuk presipitasi atau penggumpalan kembali DNA.

 

 

5.2. SARAN

      Laporannya terlalu banyak dan rumit, waktunya sebaiknya ditambah buat mengumpulkan laporannya.

 

 

DAFTAR PUSTAKA

Asris.2010.Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/.diakses pada 1 Desember 2012

Doyle. J. J and Doyle J. L. 1990. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue Focus. Moscow. 12 (1): 13.

 

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang

Purwantara, A. 2001. Principles of DNA Isolation and Manipulation. Workshop on Plant Pathogens Detection by Moleculae Tehniques. 24-26 Januari 2001.

 

Tohib.2012.Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id/2012/09/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation.html diakses pada 1 Desember 2012

Yuwono, Triwibowo.2006. BioteknolgiPertanian. GadjagMada University Press. Yogyakarta

 

About these ads

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s