LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
“KULTUR EMBRIO”

Oleh :

Nama               : Burhan Setia Budi
NIM                : 115040200111052
Kelompok       : Kamis, 09.15 WIB
Asisten            : Muhammad Arif

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. LATAR BELAKANG

Seiring dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dalam bidang pertanian, para peneliti pertanian mulai mengembangkan penanaman dengan menggunakan bagian dari jaringan tanaman dengan memanfaatkan sifat jaringan yang mengalami totipotensi. Bedanya disini adalah penanaman bukan mengguunakan media tanah atau media tanam lain yang lazim digunakan. Penanaman dilakukan dengan menggunakan media agar-agar dan unsur hara makro dan mikro yang ditambahkan kedalam media. Media tersebut harus benar-benar steril untuk didapatkan pertumbuhan yang optimal dan bukannya pertumbuhan kontaminan. Dalam metode kultur jaringan dikenal berbagai jenis kultur yang digunakan diantaranya adalah kultur organ.

Dalam ilmu fisiologi terdaapat berbagai jenis kultur diantaranya adalah kultur organ, kultur embrio, dan kultur anther. Kultur organ daun digunakan untuk studi deferensiasi dan fungsi dari jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan keadaan lingkungan dapat di eksplorasi secara lebih tepat dalam kultur In Vitro. Eksplan yang sering digunakan untuk perbanyakan tanaman cocor bebek secara in vitro adalah bagian daun, karena mitosis pada sel-sel yang berkesinambungan sehingga ekstra duplikasi DNA dapat dihindari.

Kultur embrio merupakan kultur yang menggunakan embrio yang diperoleh dari benih suatu tanaman yang diambil embrionya. Embrio tersebut di tanam pada media kultur untuk mengintensifkan pertumbuhan embrio tersebut. Dalam laporan praktikum ini akan di bahas mengenai kultur embrio dan cara pelaksanaan dalam pembuatan kultur embrio.

1.2. TUJUAN

– Untuk mengetahui teknik dan cara melakukan kultur organ.

– Untuk mengetahui tahapan-tahapan dan proses dalam megkultur organ.

– Untuk memahami apa itu kultur organ.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. MORFOLOGI KACANG TANAH DAN BIJI ANGGREK

2.1.1. Tanaman Kacang Tanah

Akar
Sistem akar merupakan akar tunggang yang telah berkembang menjadi baik dengan banyak akar-akar lateral, tidak memiliki rambut akar, dan memiliki bintil akar untuk mengikat nitrogen.
Berbentuk cabang percabangan terdiri dari dua jenis yaitu dengan cabang vegetatif dan cabang reproduktif. Cabang vegetatif dicirikan dengan adanya daun sisik yang disebut katofil yang terdapat pada 2 buku pertama pada cabang. Cabang vegetatif sekunder dan tertier dapat berkembang dari cabang vegetatif primer.
Daun pada batang utama tersusun spirat, pada cabang vegetatif primer tersusun berseling, berdaun 4, dengan 2 pasang daun duduk berhadapan berbentuk membundar telur sungsang berukuran 3 – 7 cm x 2 – 3 cm, panjang tangkai daun 3 – 7 cm, terdapat bagian yang menggembung pada dasar tangkai daun pada dasar setiap daun. Hal ini merupakan ciri adanya pergerakan pada malam hari yaitu tangkai daun akan menggulung ke bawah dan daun akan menggulung ke atas sampai keduanya bersentuhan.
Cabang perbungaa berbentuk tunggal pada katafil dan ketiak daun pada cabang vegetatif dan ada beberapa yang tumbuh pada buku teratas pada batang. Pada setiap perbungaan terdapat 2 – 5 bunga, bunga duduk berwarna kuning muda hingga jingga kemerahan.
Buah polong berbentuk silindris, berisi 1 – 6 biji buah yang siap dipanen memiliki ciri warna coklat kehitam-hitaman.
Setiap biji diliputi oleh selaput biji tipis berwarna antara putih hingga merah muda, merah, ungu, coklat kemerahan dan sedikit kecoklatan. Setiap biji memiliki dua keeping biji yang lebar, epikotil dengan daun dan tunas primordial, hipokotil dan akar primer.

(Wahyu, 2012)

2.1.2. Biji Anggrek

Bentuk buah anggrek berbeda-beda sesuai dengan jenisnya. Buah anggrek merupakan lentera atau capsular yang memiliki 6 rusuk. Tiga diantaranya merupakan rusuk sejati dan yang tiga lainnya adalah tempat melekatnya dua tepi daun buah yang berlainan. Di tempat bersatunya tepi daun buah tadi dalam satu buah anggrek sebesar kelingking terdapat ratusan ribu bahkan jutaan biji anggrek yang sangat lembut dalam ukuran yang sangat kecil.

Biji-biji anggrek tidak memiliki endosperm sebagai cadangan makanan , sehingga untuk perkecambahannya dibutuhkan nutrisi yang berfungsi untuk membantu pertumbuhan biji. Perkecambahan di alam sangat sulit jika tanpa bantuan fungi (jamur) yang disebut mikoriza yang bersimbiosis dengan biji-biji anggrek tersebut. Dalam kondisi lingkungan yang sesuai, hifa atau benang dari mikoriza akan menembus embrio anggrek melalui sel-sel suspensor. Kemudian fungi tersebut dicerna sehingga terjadi pelepasan nutrisi sebagai bahan energi yang digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan perkecambahan biji-biji anggrek.

(Filaha, 2012)

2.2. KONDISI OPTIMUM UNTUK TUMBUH KACANG TANAH DAN ANGGREK

Kacang Tanah

Kacang tanah (Arachis Hypogaea L) memerlukan iklim yang lebih panas dibandingkan tanaman kedelai atau jagung. Suhu harian antara 25 hingga 35⁰C tanaman kacang tanah tumbuh lambat, umurnya lebih lama, dan hasilnya kurang. Kelembaban udara yang tinggi (lebih dari 80%) kurang menguntungkan bagi pertumbuhan kacang tanah (Arachis Hypogaea), karena akan memberikan lingkungan yang sangat baik bagi pertumbuhan penyakit bercak daun dan karat. Tanah yang terlalu lembap di samping menghambat pertumbuhan tanaman, juga mendorong pertumbuhan cendawan pembusuk akar. Tanaman kacang tanah (Arachis Hypogaea L) termasuk tanaman strata A, yakni tanaman yang memerlukan sinar matahari penuh (100 %). Adanya naungan yang menghalangi sinar matahari lebih dari 30% akan menurunkan hasil. Tanaman yang ternaungi tumbuh memanjang batangnya lemah, bunga dan polong yang terbentuk sangat sedikit.

Tanaman kacang tanah (Arachis Hypogaea) memerlukan tanah yang strukturnya ringan, berdrainase baik, dan cukup unsur hara NPK, Ca dan unsur mikro. Tanah yang bertekstur lempung-berpasir, pasir-berlempung sangat cocok untuk kacang tanah. Tingkat kemasaman tanah yang optimal untuk pertumbuhan kacang tanah (Arachis Hypogaea) adalah antara pH = 6 hingga 6,5. Kacang tanah termasuk tanaman yang paling toleran terhadap tanah masam dibandingkan tanaman yang lainnya yang termasuk polong-polngan. Tanaman kacang tanah (Arachis Hypogaea) mampu hidup pada tanah yang kurang subur, sedikit masam, dan juga agak kering. Oleh karena itu kacang tanah mempunyai daerah adaptasi yang cukup luas.

(Wahyu, 2012)

Anggrek

Angin dan curah hujan tidak terlalu berpengaruh terhadap pertumbuhan tanaman anggrek. Sinar matahari sangat dibutuhkan sekali bagi tanaman ini. Kebutuhan cahaya berbeda-beda tergantung pada jenis tanaman anggrek. Ada yang memerlukan intensitas penyinaran penuh, ada juga yang tidak penuh alias memerlukan naungan. Kebutuhan cahaya berdasarkan jenis anggrek, yakni antara lain: Arachnis Maggie Oei butuh 100% intensitas penyinaran, Arachnis Apple Blossom butuh 100% intensitas penyinaran, Renanthera Hybrid butuh 100% intensitas penyinaran, Vanda pensil dan vanda quarter butuh 100% intensitas penyinaran, Dendrobium butuh 50-65% intensitas penyinaran, Aranda Hybrid butuh 50-65% intensitas penyinaran, Oncidium Hybrid butuh 60-75% intensitas penyinaran, Vanda berdaun lebar butuh 20-30% intensitas penyinaran, Phalaenopsis Hybrid butuh 10-15% intensitas penyinaran, dan Cattleya Hybrid butuh 20-30% intensitas penyinaran.

Suhu minimum untuk pertumbuhan anggrek adalah 15 derajat C dan suhu maksiumnya adalah 28 derajat C. Jika suhu udara malam berada di bawah 13 derajat C, maka daerah tersebut tidak dianjurkan untuk ditanam anggrek (di dataran tinggi Dieng). Berdasarkan kebutuhan suhu, tanaman anggrek dibedakan menjadi tiga tipe, yakni: 1) Anggrek tipe dingin, membutuhkan suhu siang sekitar 18-21 derajat C. Anggrek yang termasuk dalam tipe ini adalah Cymbidium sp. dan Miltona sp. 2) Anggrek tipe sedang, membutuhkan suhu siang sekitar 21-24 derajat C, dan suhu malam sekitar 18-21 derajat C. Anggrek yang termasuk tipe ini adalah Dendrobium sp. dan oncidium sp. 3) Anggrek tipe hangat, membutuhkan suhu siang sekitar 24-29 derajat C dan suhu malam 21-24 derajat C. Anggrek yang termasuk dalam tipe ini adalah Vanda sp., Arachnis sp., dan Renanthera sp.

Kelembaban nisbi (RH) yang diperlukan untuk anggrek berkisar antara 60–85%. Fungsi kelembaban yang tinggi bagi tanaman antara lain untuk menghindari penguapan yang terlalu tinggi. Pada malam hari kelembaban dijaga agar tidak terlalu tinggi, karena dapat mengakibatkan busuk akar pada tunas-tunas muda. Oleh karena itu diusahakan agar media dalam pot jangan terlampau basah. Sedangkan kelembaban yang sangat rendah pada siang hari dapat diatasi dengan cara pemberian semprotan kabut di sekitar tempat pertanaman dengan bantuan sprayer.

Media untuk anggrek epifit dan semi epifit terdiri dari: serat pakis yang telah digodok, kulit kayu yang dibuang getahnya, serabut kelapa yang telah direndam air selama 2 minggu, ijuk, potongan batang pohon enau, arang kayu, pecahan genting/batu bata, bahan-bahan dipotong menurut ukuran besar tanaman dan akarnya. Untuk anggrek semi epifit yang akarnya menempel pada media untuk mencari makanan, perlu diberi makanan tambahan seperti kompos, pupuk kandang/daun-daunan. Media untuk anggrek terrestria : Jenis anggrek ini hidup di tanah maka perlu ditambah pupuk kompos, sekam, pupuk kandang, darah binatang, serat pakis dan lainnya. Media untuk anggrek semi terrestria : Bahan untuk media anggrek ini perlu pecahan genteng yang agak besar, ditambah pupuk kandang sekam/serutan kayu. Dipakai media pecahan genting, serabut kayu, serat pakis dan lainnya.

Ketinggian tempat yang cocok bagi budidaya tanaman ini dapat dibedakan menjadi 3 macam yaitu: Anggrek panas (ketinggian 0-650 m dpl) : Anggrek panas memerlukan suhu udara 26-30 derajat C pada siang hari, 21 derajat C pada malam hari, dengan daerah ketinggian 0-650 meter dpl. Contoh jenis anggrek ini adalah: Dendrobium phalaenopsis, Onchidium Papillo, dan Phaphilopedillum Bellatum. Anggrek sedang (ketinggian 150-1500 m dpl) : Anggrek sedang pada suhu udara siang hari 21 derajat C dan 15–21 derajat C,pada malam hari, dengan ketinggian 150-1500 m dpl. Anggrek dingin (lebih dari 1500 m dpl) : Anggrek dingin jarang tumbuh di Indonesia, tumbuh baik pada suhu udara 15-21 derajat C di siang hari dan 9–15 derajat C pada malam hari, dengan ketinggian = 1500 m dpl. Contoh: anggrek jenis Cymbidium.
(Filaha, 2012)

2.3. TEKNIK KULTUR EMBRIO KACANG TANAH DAN EMBRYO RESQUE BIJI ANGGREK

Teknik embryo culture dan embryo rescue pada dasarnya melibatkan 3 tahapan, yaitu:

1). Sterilisasi eksplan

Embrio pada prinsipnya berada dalam keadaan steril. Hal ini disebabkan karena embrio berada di dalam buah (di dalam biji) terlindung oleh jaringan-jaringan buah dan biji yang berada di luar embrio, antara lain oleh kulit buah, daging buah dan kulit biji. Keadaan ini menyebabkan sterilisasi embrio tidak perlu dilakukan. Sterilisasi permukaan perlu dilakukan pada buah ataupun biji untuk mensterilkan permukaan buah/biji sehingga pada waktu isolasi embrio tidak terdapat sumber kontaminan. Karena embrio berada di dalam, sterilisasi dapat dilakukan dengan pembakaran buah/biji atau dengan sterilan kimia seperti sodium hypochlorite dengan konsentrasi cukup tinggi (>2 %).

2). Isolasi dan penanaman embrio

Seringkali masalah timbul saat isolasi embrio terutama untuk embrio berukuran kecil sehingga isolasinya harus dilakukan di bawah mikroskop. Untuk embrio berukuran besar, isolasi embrio tidak menjadi masalah. Isolasi harus dilakukan secara hati-hati agar embrio tidak rusak dan kehilangan salah satu atau lebih bagian-bagiannya (radicula, plumula, hypocotil, coleoptyl, dll). Selain itu harus tetap dijaga juga agar isolasi dilakukan dalam kondisi tetap aseptis. Embrio yang telah diisolasi selanjutnya ditanam pada media yang telah dipersiapkan.

Media untuk pengecambahan embrio cukup sederhana. Kebutuhan nutrisi di dalam media untuk pengecambahan embrio juga lebih sederhana dibandingkan dengan media untuk tujuan teknik kultur yang lain. Pada prinsipnya media diperlukan untuk menggantikan peranan endosperm dalam mendukung perkecambahan embrio dan perkembangan bibit muda mengingat embrio yang ditanam umumnya telah memiliki radicula dan plumula. Media yang umum digunakan untuk pengecambahan embrio adalah media Knudson dan Vacin & Went (untuk anggrek), Media MS dalam ½ konsentrasi garam-garamnya. Dalam pengecambahan embrio dewasa umumnya vitamin tidak ditambahkan dalam media, namun sumber karbon tetap diperlukan meskipun dalam konsentrasi yang lebih rendah (umumnya 20 g/l). Akan tetapi, dalam pengecambahan embrio muda diperlukan media yang lebih kompleks. Perkembangan embrio muda perlu didukung pada awalnya sehingga radicula dan plumula dapat berkembang sempurna sebelum embrio ini berkecambah. Untuk itu, nutrisi yang lebih lengkap beserta vitamin seperti nicotinic acid, biotin, vitamin C, vitamin B perlu ditambahkan pada media kultur embrio muda ini. Hormon tanaman umumnya tidak ditambahkan dalam media kultur embrio karena penambahan hormon tanaman kemungkinan dapat merangsang terbentuknya kalus pada embrio. Kalus umumnya tidak diinginan pada kultur embrio mengingat tujuan kulturnya adalah untuk merangsang perkecambahan embrio. Pada beberapa kasus, terutama untuk embrio muda atau embrio yang mengalami dormansi, penambahan giberellin dalam media kultur dapat dilakukan. Untuk pengecambahan embrio umumnya digunakan media padat sehingga agar pada konsentrasi 0,8 sampai 1,6 % ditambahkan ke dalam media. Media cair kadangkala diperlukan untuk pengecambahan, misalnya pada embrio kelapa. Kondisi pengecambahan ini memodifikasi kondisi alamiah perkecambahan buah kelapa dimana nutrisi tersedia dari endosperm yang cair yaitu berupa air kelapa. Apabila media cair digunakan untuk pengecambahan, umumnya kultur ditempatkan di atas shaker (alat penggojok) untuk menghindari kekurangan oksigen pada eksplan yang dapat menyebabkan eksplan mati.

3). Aklimatisasi

Aklimatisasi dilakukan setelah embrio berkecambah dan diperoleh plantlet yang siap untuk dipindahkan ke lapangan. Teknik aklimatisasi untuk plantlet hasil regenerasi kultur embrio pada prinsipnya sama dengan aklimatisasi plantlet hasil regenerasi dari teknik kultur jaringan lainnya. Selain kultur embrio dan embrio rescue,terdapa pula beberapa tipe – tipe kultur lain ,yaitu: kultur kalus, kultur meristem,kultur suspensi sel, kultur protoplas, kultur anther dan pollen, dan kultur spora paku.

(Sofia, 2007)

2.4. CONTOH APLIKASI KULTUR EMBRIO

Saat ini teknik kultur jaringan digunakan bukan hanya sebagai sarana untuk mempelajari aspek-aspek fisiologi dan biokimia tanaman saja. Akan tetapi sudah berkembang menjadi metoda untuk berbagai tujuan seperti:

a. Mikropropagasi (Perbanyakan tanaman secara mikro)

Teknik kultur jaringan telah digunakan dalam membantu produksi tanaman dalam skala besar melalui mikropropagasi atau perbanyakan klonal dari berbagai jenis tanaman. Jaringan tanaman dalam jumlah yang sedikit dapat menghasilkan ratusan atau ribuan tanaman secara terus menerus. Teknik ini telah digunakan dalam skala industri di berbagai negara untuk memproduksi secara komersial berbagai jenis tanaman seperti tanaman hias (anggrek, bunga potong, dll.), tanaman buah-buahan (seperti pisang), tanaman industri dan kehutanan (kopi, jati, dll). Dengan menggunakan metoda kultur jaringan, jutaan tanaman dengan sifat genetis yang sama dapat diperoleh hanya dengan berasal dari satu mata tunas. Oleh karena itu metoda ini menjadi salah satu alternatif dalam perbanayakan tanaman secara vegetatif.

b. Perbaikan tanaman

Seperti telah diketahui bahwa dalam usaha perbaikan tanaman melalui metoda pemuliaan secara konvensional untuk mendapatkan suatu galur murni akan memerlukan enam atau tujuh generasi hasil penyerbukan sendiri maupun persilangan. Melalui teknik kultur jaringan, antara lain dengan cara memproduksi tanaman haploid melalui kultur polen, antera atau ovari yang diikuti dengan penggandaan kromosom, akan mempersingkat waktu untuk mendapatkan tanaman yang homozigot.

c. Produksi tanaman yang bebas penyakit (virus)

Teknologi kultur jaringan telah memberikan kontribusinya dalam mendapatkan tanaman yang bebas dari virus. Pada tanaman yang telah terinfeksi virus, sel-sel pada tunas ujung (meristem) merupakan daerah yang tidak terinfeksi virus. Dengan cara mengkulturkan bagian meristem pada media kultur yang cocok akan diperoleh tanaman yang bebas virus. Teknik ini telah banyak digunakan dalam memproduksi berbagai tanaman hortkultura yang bebas penyakit.

d. Transformasi genetik

Teknik kultur jaringan telah menjadi bagian penting dalam membantu keberhasilan rekayasa genetika tanaman (transfer gen). Sebagai contoh transfer gen bakteri (seperti gen cry dari Bacillus thuringensis) kedalam sel tanaman akan terekspresi setelah regenerasi tanaman transgeniknya tercapai.

e. Produksi senyawa metabolit sekunder

Kultur sel-sel tanaman juga dapat digunakan untuk memproduksi senyawa biokimia (metabolit sekunder) seperti alkaloid, terpenoid, phenyl propanoid dll. Teknologi ini sekarang sudah tersedia dalam skala industri. Sebagai contoh produksi secara komersial senyawa “shikonin” dari kultur sel Lithospermum erythrorhizon.

(Zulkarnain, 2009)

2.5. FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KEBERHASILAN KULTUR EMBRYO DAN EMBRYO RESQUE

Faktor yang mempengaruhu keberhasilan kultur embrio adalah:

Genotipe

Pada suatu spesies, embrio mudah diisolasi dan tumbuh, sementara pada tanaman lain agak lebih susah.

Tahap (stage) embrio diisolasi

Pada tahapan yang lebih besar (lebih tinggi) lebih baik bila dilakukan pengisolasian embrio.

Kondisi tumbuhan

Sebaiknya ditumbuhkan di rumah kaca/ kondisi terkontrol. Embrio harus cukup besar dan berkualitas tinggi.

Kondisi media

Hara makro dan mikro

pH 5.0 – 6.0c. Sukrosa sebagai sumber energi. Embrio yang belum matang perlu 8–12%,embrio matang perlu 3% Auksin dan sitokinin tidak diperlukan. GA diperlukan untuk memecahkan dormansi

Vitamin (optional)

Senyawa organik (opt), air kelapa, casein hydrolisate, glutamin (penting)

Lingkungan

Oksigen (perlu oksigen tinggi). Cahaya : kadang embrio perlu ditumbuhkan dalam gelap selama 14 hari,kemudian ditransfer ke cahaya untuk merangsang sintesa klorofil. Suhu : kadang perlu perlakuan dingin (vernalisasi, 40°C) untuk memecah dormansi

(Yusnita, 2004)

BAB III
BAHAN DAN METODE

3.1. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
Pisau potong   : untuk memotong kotiledon kacang tanah
Pinset besar    : memegang biji kacang tanah saat pemotongan
Pinset kecil      : menanam embrio kacang tanah pada media kultur
LAFC              : tempat penanaman eksplan embrio kacang tanah
Botol semprot : tempat alcohol
Bunsen            : membakar dan menyeterilkan mulut botol kaca
Cawan Petri    : tempat meletakkan hasil embrio yang telah di buka dari biji

b. Bahan
Botol kaca yang telah diisi media kultur MS : media pertumbuhan embrio
Spirtus : bahan bakar Bunsen
Biji Kacang tanah : bahan yang akan di ambil embrionya

3.2. CARA KERJA

Menyediakan alat dan bahan yang dibutuhkan

Meletakkan biji kacang tanah pada cawan petri

Biji kacang tanah di ambil embrionya dengan menggunakan pinset dan pisau potong

Botol dibuka disebelah Bunsen dengan tepi botol dibakar

Embrio di tanam pada media kultur (1 botol 3 embrio)

Botol di tutup kembali dengan Aluminium foil / Plastik

Botol ditempatkan pada ruang inkubasi

3.3. ANALISA PERLAKUAN

Dalam praktikum ini di perlukan alat-alat diantaranya adalah LAFC, Bunsen, pinset besar, pnset kecil, pisau potong, botol semprot dan cawan petri. Bahan yang perlu di siapkan adlah botol kaca yang telah berisi media MS (siap pakai), bji kacang tanah, alcohol dan spirtus. Tahap pertama adalah sterilasisai alat dengan menggunakan alcohol. Lalu biji kacang tanah dibuka untuk diambil embrionya. Membuka botol kaca di dalam LAFC dan di dekatkan dengan Bunsen. Embrio kacang tanah tersebut ditanam dalam media MS. Lalu ditutup kembali dengan menggunakan aluminium foil atau plastic. Setelah selesai penanaman pada media MS, botol diletakkan pada ruang inkubasi.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. HASIL

Pengamatan pertama hari Senin, 6 November 2012

Botol	Gambar	Kondisi ekspan	Jenis kontaminan	Keterangan pertumbuhan
1		Masih segar	Tidak ada kontaminan	Sudah tumbuh tunas
2		Masih segar	Tidak ada kontaminan	Mulai tumbuh tunas
3		Masih segar	Tidak ada kontaminan	Belum tumbuh tunas
4		Masih segar	Tidak ada kontaminan	Mulai tumbuh tunas
5		Masih segar	Tidak ada kontaminan	Mulai tumbuh tunas

Pengamatan ke-2, hari Rabu 28 November 2012

Botol	Gambar	Kondisi ekspan	Jenis kontaminan	Keterangan pertumbuhan
1		Eksplan tetap segar dan tumbuh tunas	Tidak ada kontaminan	Sudah tumbuh tunas semuanya
2		Eksplan tetap segar dan tumbuh tunas	Tidak ada kontaminan	Tunas sudah tumbuh, dari 3 embrio yang tumbuh 2 embrio
3		Eksplan tidak tumbuh tunas	Terkontaminasi bakteri	Tidak muncul tunas, dan terkontaminasi bakteri sebab terdapat lender pada media kultur
4		Eksplan tumbuh tidak terbalik	Terkontaminasi jamur, terdapat hifa berwarna putih	Tunas tumbuh semua dan terkontaminasi jamur, terdapat hifa jamur berwarna putih
5		Eksplan tumbuh 2, tidak terbalik	Terkontaminasi jamur, terdapat hifa berwarna putih	Tumbuh tunasnya, tetapi terkontaminasi jamur sebab pada media terdapat hifa berwarna putih

Pengamatan ke-3, hari Kamis 29 November 2012

Botol	Gambar	Kondisi ekspan	Jenis kontaminan	Keterangan pertumbuhan
1		Eksplan sudah tumbuh tunas, tunas terbalik pertumbuhannya	Tidak ada kontaminan	Tunas tumbuh terbalik, dan tidak ada kontaminan
2		Eksplan sudah tumbuh tunas, tunas terbalik pertumbuhannya	Tidak ada kontaminan	Tunas tumbuh 2 terbalik, dan tidak ada kontaminan
3		Eksplan mati	Terkontaminasi bakteri, pada media kultur terdapat lendir	Tunas tidak tumbuh dan terkontaminasi bakteri
4		Eksplan tumbuh semua, tidak terbalik	Terkontaminasi jamur	Tunas tumbuh, terkontaminasi jamur
5		Eksplan tumbuh 2	Terdapat kontaminan jamur (ada hifa pada media kultur), dan bakteri (terdapat lendir)	Tunas tumbuh 2, dan terkontaminasi jamur dan bakteri

Pengamatan ke-4 hari Jumat 30 November 2012

Botol	Gambar	Kondisi ekspan	Jenis kontaminan	Keterangan pertumbuhan
1		Eksplan tumbuh semua, terbalik pertumbuhannya	Tidak ada kontaminan	Tunas tumbuh terbalik
2		Eksplan tumbuh 2, terbalik pertumbuhannya	Tidak ada kontaminan	Tunas tumbuhnya terbalik
3	–	Eksplan mati	Terkontaminasi bakteri	Tunas mongering dan mati, terkontaminasi bakteri
4	–	Eksplan tumbuh tapi mulai layu	Terkontaminasi jamur	Eksplan tumbuh tapi mulai layu
5	–	Eksplan tumbuh tapi mulai layu	Terkontaminasi jamur dan bakteri	Pertumbuhan tunas terhenti karena sudah terkontaminasi jamur dan bakteri

4.2. PEMBAHASAN

Pada pengamatan pertama yang dilakukan pada senin 6 November 2012 didapatkan hasil sebagai berikut : Pada botol pertama kondisi eksplan masih terlihat segar, untuk pertumbuhan tunasnya masih mulai tumbuh. Pada botol kedua kondisi eksplan masih terlihat segar, untuk pertumbuhan tunasnya masih mulai tumbuh. Pada botol ketiga kondisi eksplan masih terlihat segar, untuk pertumbuhan tunasnya belum mulai tumbuh. Pada botol keempat kondisi eksplan masih terlihat segar, untuk pertumbuhan tunasnya masih mulai tumbuh. Pada botol kelima kondisi eksplan masih terlihat segar, untuk pertumbuhan tunasnya masih mulai tumbuh.
            Pada pengamatan kedua dilakukan pada Rabu, 8 November 2012. Pada pengamatan tersebut didapatkan hasil sebagai berikut. Pada botol pertama kondisi eksplan tetap segar, tidak terdapat kontaminan baik pada media kultur ataupun pada embrionya dan mulai tumbuh tunas. Kondisi pada botol kedua, kondisi eksplannya masih segar, dan sudah tumbuh 2 tunasnya, serta tidak terdapat kontaminan pada media ataupun eksplannya. Pada botol ketiga, kondisi eksplannya tidak tumbuh, dan pada media kulturnya terdapat kontaminas bakteri dengan ciri terdapat lendir putih pada media kulturnya, dan berbau busuk. Pada botol keempat eksplan tumbuh semua dan penanamanya tidak terbalik, tetapi terdapat kontaminan berupa jamur dengan cirri-ciri terdapat hifa berwarna putih. Pada botol kelima eksplan tumbuh 2, dan yang satu belum tumbuh, terdapat kontaminan berupa jamur (terdapat hifa).
            Pengamatan ketiga di lakukan pada Kamis, 29 November 2012. Padaa botol pertama kondisi eksplan sudah tumbuh agak panjang, tetapi tumbuhnya terbalik karena salah pada saat penanaman, jumlah eksplan yang tumbuh ada 3 tanaman, dan tidak terdapat kontaminasi pada eksplan ataupun pada media kultur. Pada botol kedua kondisinya sama seperti pada botol pertama yaitu salah perlakuan pada saat penanaman eksplan di media kultur, jumlah eksplan yang tumbuh ada 2 tanaman dan tidak terdapat kontaminasi. Botol ketiga kondisi eksplannya mati, dan terdapat kontaminasi bakteri (media kultur terdapat lendir berwarna putih dan berbau). Pada botol keempat eksplan tumbuh 3 tanaman dan tidak terbalik, tetapi terdapat kontaminan yaitu berupa jamur pada media kultur. Pada botol kelima kondisi eksplan masih tumbuh, tetapi hanya 2 tanaman yang tumbuh dan terdapat kontaminan jamur dan bakteri, pada awalnya kontaminan hanya jamur saja tetapi setelah beberapa hari baru muncul bakteri.
            Pengamatan ke-4 dilakukan pada hari Jum’at tanggal 30 November 2012. Pada pengamatan terakhir ini hanya terdapat dua botol yang berhasil bertahan. Yaitu pada botol pertama dan kedua, pada botol pertama jumlah eksplan yang berhasil tumbuh ada 3 tanaman, dan pada botol kedua eksplan yang berhasil tumbuh ada 2 tanaman serta pada kedua botol tersebut tidak ditemukan adanya kontaminan. Tetapii kondisi tanaman pada botol pertama dan kedua terbalik karena penanaman eksplan yang terbalik. Untuk botol ketiga dari awal eksplan tidak tumbuh dan terkontaminasi bakteri. Pada botol ke empat eksplan masih tumbuh dan mulai layu karena terknotaminasi jamur, hal itu sama pada botol keliama yaitu eksplan masih tumbuh dan mulai layu karena terkontaminasi jamur dan bakteri.

4.3.PEMBAHASAN TENTANG PERTUMBUHAN KULTUR EMBRYO

Pada kultur embrio hasilnya yang berhasil ada 2 botol. Ke tiga botolyang lain gagal dikarenakan terkontaminasi oleh jamur dan bakteri. Selain itu persilangan antarspesies, umur embrio saat dikulturkan sangat mempengaruhi keberhasilan persilangan, mengingat embrio yang gugur sangat tinggi dan hal ini tidak dapat diduga sebelumnya. Pada penelitian ini, keguguran polong/ embrio berlangsung sejak hari pertama sampai hari ke- 21 setelah polinasi. Di lain pihak, penanaman embrio yang masih sangat muda menghadapi kendala teknis sulitnya mengisolasi embrio dari polong karena ukuran embrio sangat kecil. Selain itu, penanaman embrio yang sangat muda memerlukan formulasi media yanglebih kompleks. Penggunaan embrio yang lebih matang akan mempermudah isolasi serta formulasi media yang digunakan lebih sederhana, tetapi embrio yang gugur (embrio tidak berkecambah) akan meningkat (M. Kosmiatin dan I. Mariska)

Pada kultur embrio, keberhasilan perkecambahan in vitro juga ditentukan oleh komposisi media dan zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media untuk menggantikan peran endosperma. Pengecambahan embrio yang lengkap biasanya tidak memerlukan formulasi media yang rumit, bahkan pada beberapa jenis tanaman, embrio dapat tumbuh pada media dasar tanpa zat pengatur tumbuh, seperti pada embrio hasil persilangan S. khasianum dan S. capsicoides (Handayani 1995).

BAB V

PENUTUP

5.1.KRITIK
Untuk praktikum kultur embrio sudah baik, tetapi ada kesalah pahaman tentang peletakan posisi embrio pada media MS. Hal tersebut tidak masalah karena yang terbalik justru yang tidak terkontaminasi, tapi untuk selanjutnya semoga tidak terulang lagi.

Pergiliran praktikan yang bekerja untuk penanaman di LAFC sangat tapat, biar semua merasakan dan mencoba pada saat penanaman eksplan. Good job.

Bahan yang untuk embrio recsue kehabisan, apakan penyediaannya sangat sedikit. Dimohon untuk alat dan bahan disediakan secara lengkap.

5.2.SARAN
Sarannya, semoga praktikum kedepannya lebih sukses dan berhasil.

DAFTAR PUSTAKA

Filaha.2012. Morfologi dan Syarat Tumbuh Tanaman Anggrek. http://euisnovitasari.blogspot.com/2011/07/morfologi-anggrek.html. Diakses pada tanggal 1 Desember 2012.

Sofia, D. 2007. Kultur Jaringan Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Panebar Swadaya. Jakarta..

Handayani, T. 1995. Persilangan Antarjenis Solanum khasianum CLARKE dan Solanum capsicoides ALL dengan Penyelamatan Embrio dan Perlakuan Kolkisin. Tesis Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Yusnita., 2004. Kultur Jaringan Tanaman. PT Agromedia Pustaka. Jakarta.

Zulkarnain., 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara. Jakarta.

Wahyu.2012.Morfologi dan Syarat Tumbuh Kacang Tanah. http://wahyuaskari.wordpress.com/akademik/tanaman-kacang-tanah/. Diakses pada tanggal 1 Desember 2012.

LAPORAN ISOLASI DNA KASAR

Januari 5, 2013 by burhansetiabudi | Tinggalkan komentar

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
“ISOLASI DNA KASAR”

Oleh :

Nama               : Burhan Setia Budi
NIM                 : 115040200111052
Kelompok        : Kamis, 09.15 WIB
Asisten             : Muhammad Arif

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

BAB I
PENDAHULUAN

1.1.LATAR BELAKANG

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNAmitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskansifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisansifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuahsel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruhsistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimilikisuatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah.Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimanaterdapat DNA didalamnya.

Pentingnya pengetahuan tentang DNA dan cara mengisolasinya ini akan dibahas dibahas tentang cara untuk mengisolasi DNA kasar dengan menggunakan alat dan bahan yang sederhana.

1.2.TUJUAN

– Mengetahui definisi isolasi DNA

– Mengetahui metode dan tahapan dalam isolasi DNA

– Mengetahui manfaat isolasi DNA

1.3.MANFAAT

– Mahsiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. DEFINISI ISOLASI DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.

(Arsis, 2010)

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak.

(Yuwono, 2006)

DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis. Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya.

(Doyle, 1990)

DNA isolation is one of the most basic and essential techniques in the study of DNA. The extraction of DNA from cells and its purification are of primary importance to the field of biotechnology and forensics. Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling dasar dan penting dalam studi DNA. Ekstraksi DNA dari sel dan pemurnian yang merupakan kepentingan utama untuk bidang bioteknologi dan forensik.

(Purwantara, A. 2001)

2.2. MACAM METODE ISOLASI DNA

a. Kitchen Preparation

ada 4 hal penting yang harus kita lakukan untuk melakukan isolasi DNA yaitu:

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. pemecahan dinding sel.
3. pemecahan membran sel.
4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara fisik dengan menumbuk atau menggerus bahana yang akan kita gunakan. bahkan bahan yang lunak seperti strowberry cukup hanya diremas-remas saja.

Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA)bisa keluar.

Jika perlu kita dapat menambahkan proteinase (enzim pengurai protein) untuk menyingkirkan protein yang mungkin akan mengotori bahan yang kita inginkan. Proteinase alami yang dapat kita gunakan adalah papain yang merupakan ekstrak daun pepaya, atau bromelin yang merupakan ekstrak buah nanas.

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan.

(Tohib, 2012)

b. CTAB

CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat (Kaidah dan Suprapto, 2003), merusak membran sel dan melarutkan DNA ( Purwantara, 2001). Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.

Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996). Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein (Milligan, 1992). Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel.

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA (Ningrum, 2008). Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi (Purwantara, 2001). Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.

Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Sudarsono, 1996).

Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit ( Ningrum, 2008). Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Wyatt and Brown, 1996).

2.3. PERBEDAAN ISOLASI DNA KASAR DENGAN ISOLASI DNA BUFFER EKSTRAKSI

Isolasi DNA kasar (Kitchen Preparation)	Isolasi DNA halus dengan buffer ekstraksi (CTAB)
memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA dengan megunakan deterjen dan garam dapur	Memecahkan dinding sel dan membran sel dengan detergen modifikasi CTAB dan mercaptoetanol
Tidak ada pemanasan pada proses ini	Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol
Tidak ada pengendapan komponen polisakarida	Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA
Tidak ada penambahan buffer TE	Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak
Di ambil larutan supernatan yang bercampur dengan kontaminaan lainnya	Supernatan yang diambil kontaminannya sangat sedikit
ekstraksi DNA dengan kitchen preparation akan menghasilkan DNA kasar yang menggumpal dan belum murni (masih banyak zat lain yang terkandung)	ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility)

(Yuwono, 2006)

2.4. MANFAAT ISOLASI DNA

Ada manfaat dari isolasi DNA, antara lain:

Mendapatkan DNA murni yang akan digunakan dalam percobaan laboratorium tertentu.
Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern
Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,
Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

(Arsis, 2010)

BAB III
METODOLOGI

3.1. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
Cutter                     : mengupas dan memotong mangga
Mortar dan pestile : menghaluskan buah mangga
Spatula                   : mengambil bubur mangga dan menggaduk laruran
Baker glass                        : menampung larutan
Gelas ukur             : mengukur volume larutan
Timbangan analytic           : menimbang bahan yang akan dipakai
Pipet                      : mengambil larutan

b. Bahan
Buah mangga         : bahan yang akan di isolasi DNAnya
Detergen
Rinso bubuk          : melisis sel
Rinso cair             : melisis sel
BuCream               : melisis sel
Aquadest               : pelarut
Garam                    : mengendapkan kotoran
Ethanol dingin       : menggumpalkan DNA

3.2. LANGKAH KERJA

Menyiapkan alat dan bahan

Mengupas mangga dan di ambil daging buahnya 5 gram
sample sebanyak 3

Daging mangga dihaluskan

Di masukkan dalam baker glass dan di tambah detergen
(masing-masing sample 2,5 garm dengan detergen yang berbeda)

Diaduk dan di biarkan selama 10 menit

Larutan yang di tengah di ambil sebanyak 5 ml

Di masukkan dalam tabung gelas

Ditambah dengan ethanol dingin 5 mL

Diamati penggumpalan DNA

Hasil dan dokumentasi

3.3. ANALISA PERLAKUAN

Langkah pertama yang dilakukan adalah mengupas buah mangga dan diambil daging buahnya sebanyak 5 gram utuk setiap sample. Di gunakan 3 sample dengan masing-masing bahan untuk melisis sel yang berbeda yaitu sample pertama menggunakan Rinso cair, sample kedua menggunakan Rinso bubuk, dan sample yang ketiga menggunakan BuCream. Daging mangga di haluskan dengan menggunakan mortar dan pestile. Setelah halus di masukkan ke dalam beaker glass dan di tambah detergen 2,5 gram dan garam sebanyak 2,5 gram. Di larutkan dengan menggunakan aquadest sebanyak 50 ml. Di aduk sampai semuanya tercampur merata. Di diamkan selama 10 menit supaya larutan menggendap. Setelah 10 menit larutan di ambil supernatannya sebanyak 5 ml, dan dimasukkan ke dalam gelas reaksi. Kemudian ditambah dengan ethanol dingin sebanyak 0,6 ml. Diamati penggumpalan DNAnya dan didokumentasikan.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. HASIL

Gambar larutan setelah bahan dicampurkan (buah mangga, detergen, garam, dan aquadest)

Gambar setelah larutan diambil supernatan dan ditambah dengan ethanol dingin

Gambar sample dengan menggunakan detergen cair

Gambar sample dengan menggunakan detergen bubuk

Gambar sample dengan menggunakan detergen cream

4.2. PEMBAHASAN

Dari hasil praktikum mengenai isolasi DNA kasar didapatkan data gambar seperti diatas. Pada sample pertama yang menggunakan detergen cair cairan berwaarna bening kebiruan dengan penampakan gumpalan DNA yang sangat sedikit. Terdapat bintik-bintik putih seperti jentik yang menyebar dilarutan, itulah yang dimaksud gumpalan DNA. Jumlahnya hanya sedikit dan tersebar di seluruh larutan.

Pada sample kedua yaitu menggunakan detergen bubuk (Rinso Bubuk), di dapatkan hasil larutan yang berwarna coklat muda kebiruan. Pada larutan tersebut terdapat bintik memanjang berwarna putih. Gumpalan DNA lebih panjang dan lebih jelas terlihat. Tersebar di seluruh larutan dengan jumlah yang banyak.
Pada sample ketiga yang menggunakan detergen cream (BuCream) didapatkan larutan berwarna biru muda agak keruh. Pada larutan terdapat gumpalan DNA yang agak jelas dan jumlah yang agak banyak.

Kesimpulannya adalah jumlah gumpalan DNA terlihat paling banyak di sample yang menggunakan detergen bubuk, selanjutnya adalah yang menggunakan detergen cream (BuCream), dan yang paling sedikit adalah yang menggunakan detergen cair (RinsoCair).

Menurut Jamilah (2005: 95) diantara detergen bubuk, detergen Rinso menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan konsentrasi air tinggi.

Sedangkan untuk mengetahui fungsi detergen dalam isolasi DNA ini menurut (Jamilah, 2005: 11) dalam proses isolasi DNA, detergen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler yang dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa “memakan” DNA).

Selain lisozim dan EDTA, bisa juga digunakan detergen seperti sodium dodesil sulfat (SDS) karena detergen ini bisa menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel, sehingga bisa meusak struktur membran sel (Tim Dosen Biologi FMIPA UB, tanpa tahun: 19-20). Anonim (tanpa tahun, dalam Jamilah, 2005: 11) menyatakan bahwa detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel engan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat. Dollard (2005, dalam Jamilah, 2005: 11) menambahkan bahwa detergen ini kemudian membentuk kompleks dengam lipid dan protein dan menyebabkannya terpresipitasi ke dalam larutan.

Zubaidah (2004: 38) menambahkan bahwa padasaat penghancuran jaringan sampel pada awal proses isolasi DNA, terjadi pelepasan senyawa polifenol dan polisakarida. Senyawa polifenol yang teroksidasi akan mengadakan ikatan kovalen dengan DNA yang membentuk suatu senyawa kompleks berwarna kecokelatan, sedangkan polisakarida mengalami kompresipitasi dengan asam nukleat saat presipitasi dengan penambahan alkohol sehingga terbentuk suatu matriks seperti lem dalam jumlah berlebihan. Hal ini dapat menyebabkan DNA menjadi kental, sulit larut secara sempurna dan sulit di pipet meskipun telah dilarutkan dalam buffer TE. Akan tetapi jika ditinjau dari sudut pandang media, DNA yang baik adalah DNA yang serupa pintalan benang.

Ditinjau dari faktor penambahan garam ke dalam larutan detergen pada proses isolasi DNA, garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994, dalam Jamilah, 2005: 21). Dari pernyataan tersebut, nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA.

Konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain: keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu ethanol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. (Jamilah, 2005: 21).

Menurut (Jamilah, 2005: 21-22) pada saat penambahan ethanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada di bagian dasar tabung karena ethanol memiliki densitas (kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air. DNA akan tampak nyata sebagai strands (unting) putih atau suatu bahan yang kental dengan gelembung udara yang terperangkap di dalamnya. Gelembung ini yang akan menyebabkan DNA naik ke bagian atas larutan.

Ditinjau dari jenis buah yang digunakan sebagai sumber DNA, buah yang memiliki kadar air rendah menghasilkan presipitasi DNA yang lebih baik daripadabuah yang kadar airnya tinggi Kecepatan pembentukan DNA juga dipengaruhi oleh jenis detergen yang digunakan, dalam hal ini detergen cair (Rinso cair) memiliki kualitas kurang baik dalam pembentukan DNA pada ekstrak buah. Ini karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain.

BAB V
PENUTUP

5.1. KESIMPULAN

Dari hasil praktikum didapatkan data sebagai berikut        :
      Dari ketiga sample yang digunakan ( detergen cair, detergen bubuk, dan detergen cream), DNA yang paling banyak terlihat adalah pada sample yang menggunakan detergen bubuk, setelah itu detergen cream, dan yang paling sedikit adalah yang menggunakan detergen cair.
      Detergen pada isolasi DNA ini berfungsi untuk melisis dinding sel, dan garam untuk mengendapkan kotoran yang terbawa, sedangkan ethanol dingin berfungsi untuk presipitasi atau penggumpalan kembali DNA.

5.2. SARAN

Laporannya terlalu banyak dan rumit, waktunya sebaiknya ditambah buat mengumpulkan laporannya.

DAFTAR PUSTAKA

Asris.2010.Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/.diakses pada 1 Desember 2012

Doyle. J. J and Doyle J. L. 1990. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue Focus. Moscow. 12 (1): 13.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang

Purwantara, A. 2001. Principles of DNA Isolation and Manipulation. Workshop on Plant Pathogens Detection by Moleculae Tehniques. 24-26 Januari 2001.

Tohib.2012.Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id/2012/09/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation.html diakses pada 1 Desember 2012

Yuwono, Triwibowo.2006. BioteknolgiPertanian. GadjagMada University Press. Yogyakarta

LAPORAN ISOLASI DNA HALUS

Januari 5, 2013 by burhansetiabudi | Tinggalkan komentar

LAPORAN PRAKTIKUM
BIOTEKNOLOGI
“ISOLASI DNA”

Oleh :

Nama               : Burhan Setia Budi
NIM                 : 115040200111052
Kelompok        : Kamis, 09.15 WIB
Asisten             : M. Arif

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

1.2 TUJUAN

Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR
Untuk mengetahui uji kualitas DNA
Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR
Untuk mengetahui manfaat PCR

1.3

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PENGERTIAN ISOLASI DNA DAN PCR

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Definisi PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip kerjanya memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis.Teknik PCR telah dikembangan untuk diagnosis berbagai penyakit infeksi,seperti Hepatitis, HIV, Human Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M. Tuberculosis.

2.2 UJI KUALITAS DNA

Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri.

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009).

Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain :

1. Spektrofotometri Vis (Visible)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua cahaya yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visible).

Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.Alat ini bekerja berdasarkan hukum Lambert-beer.“Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan ketebalan sel (b), konsentrasi analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu spesi (senyawa) pada suatu panjang gelombang”Logika prinsip dari alat spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang diserap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang diserap.Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.

Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil (Riyadi, 2009).

Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna (chromogenik reagent) :

1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.

2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.

3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.

4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran.

5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.

6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehendaki tidak sempurna.

7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.

Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini :

1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.

2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya (ε) besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi.

3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.

4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.

5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.(Wanibesak, E. 2011)

Gb 1. Spektrofotometer Visible tipe spectronic-20 lama yang sudah jarang bahkan mungkin tidak diproduksi lagi

Gb 2. Spektrofotometer Visible tipe Spectronic-20 terbaru.

Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :

[DNA] = Å260 x 50 x Faktor pengenceran

Keterangan :

Å260 = nilai absorbansi pada 260 nm

50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)

[RNA] = Å260 x 40 x Faktor pengenceran

Keterangan :

40= 40 ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA) (Fatchiyah, 2011).

2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible)

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuatberwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi.

Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2011).

DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011). Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Larasati, 2011).

Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri UV-Vis antara lain : mikropipet, kuvet, nanodrop spektrofotometer dan seperangkat komputer. Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan aquadest sebagai blanko. Cara kerja pengujian kuantitatif DNA diawali dengan menghidukan alat nanodrop spektrofotometer. Kemudian melakukan uji blanko menggunakan aquadest. Setelah itu dilanjutkan dengan menguji isolat DNA dengan cara meneteskannya pada tempat sampel sebanyak 1 mikroliter. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan baca hasil kemurnian DNA-nya.

Gb. Nanodrop Spektrofotometer

2.3 KOMPONEN DAN TAHAPAN PCR

Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan proses PCR dapat dilihat pada gambar 1.

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier seperti tampak pada bagan di atas (Newton and Graham, 1994).

Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada akhir siklus PCR dapat dihitung secara teoritis menurut rumus:

Gambar 1. Bagan Proses Polymerase Chain Reaction

Y = (2n – 2n)X

Y : jumlah amplicon

n : jumlah siklus

X : jumlah molekul DNA templat semula

Jika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka jumlah amplicon yang diperoleh pada akhir proses PCR adalah 1.074 x 109. Dari fenomena ini dapat terlihat bahwa dengan menggunakan teknik PCR dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen DNA yang diinginkan (amplicon) secara eksponensial dalam waktu relatif singkat. Umumnya jumlah siklus yang digunakan pada proses PCR adalah 30 siklus. Penggunaan jumlah siklus lebih dari 30 siklus tidak akan meningkatkan jumlah amplicon secara bermakna dan memungkinkan peningkatan jumlah produk yang non-target. Perlu diingat bahwa di dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidak terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target templat terlampau banyak, jumlah polimerase DNA terbatas dan kemungkinan terjadinya reannealing untai target.

PELAKSANAAN PCR

Untuk melakukan proses PCR diperlukan komponen-komponen seperti yang telah disebutkan di atas. Pada bagian ini akan dijelaskan secara rinci kegunaan dari masing-masing komponen tersebut.

1. Templat DNA

Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa 2 1 Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan eksperimen.

Pembuatan DNA templat dengan menggunakan metode lisis dapat digunakan secara umum, dan metode ini merupakan cara yang cepat dan sederhana untuk pendedahan DNA kromosom ataupun DNA plasmid. Prinsip metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis. Komposisi buffer lisis yang digunakan tergantung dari jenis sampel. Beberapa contoh buffer lisis yang biasa digunakan mempunyai komposisi sebagai berikut: 5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis ini umumnya digunakan untuk jenis sampel yang berasal dari biakan, sel-sel epitel dan sel akar rambut.

Contoh lain dari buffer lisis adalah buffer lisis K yang mempunyai komposisi sebagai berikut: buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2); 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis K ini biasanya digunakan untuk melisis sampel yang berasal dari sel darah dan virus. Selain dengan cara lisis, penyiapan DNA templat dapat dilakukan dengan cara mengisolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid menurut metode standar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA tersebut diisolasi.

Metode isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan tahapan yang lebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA dengan menggunakan metode lisis. Prinsip isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid adalah pemecahan dinding sel, yang diikuti dengan pemisahan DNA kromosom / DNA plamid dari komponen-komponen lain. Dengan demikian akan diperoleh kualitas DNA yang lebih baik dan murni.

2. Primer

Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. Dalam melakukan perancangan primer harus dipenuhi kriteria-kriteria sebagai berikut:

a. Panjang primer

Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih. Umumnya panjang primer berkisar antara 18 – 30 basa. Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer di tempat lain yang tidak diinginkan) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna dan ini akan menyebabkan lebih mahal.

b. Komposisi primer.

Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya. Rentetan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitas primer yang dapat memungkinkan terjadinya mispriming di tempat lain. Kandungan (G+C)) (% jumlah G dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR. Selain itu, urutan nukleotitda pada ujung 3’ sebaiknya G atau C. Nukleotida A atau T lebih toleran terhadap mismatch dari pada G atau C, dengan demikian akan dapat menurunkan spesifisitas primer.

c. Melting temperature (Tm)

Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer akan berpengaruh sekali di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Secara teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) + 4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 – 65 ^oC.

d. Interaksi primer-prime

Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari. Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang tidak dikehendaki, ini semua dapat menyebabkan spesifisitas primer menjadi rendah dan di samping itu konsentrasi primer yang digunakan menjadi berkurang selama proses karena terjadinya mispriming. Keadaan ini akan berpengaruh pada efisiensi proses PCR.

3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)

dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan.

4. Buffer PCR dan MgCl2

Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara).

Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan.

5. Enzim Polimerase DNA

Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi . Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai.

Dengan menggunakan teknik PCR, panjang fragmen DNA yang dapat diamplifikasi mencapai 35 kilo basa. Amplifikasi fragmen DNA pendek (kurang dari tiga kilo basa) relatif lebih mudah dilakukan. Untuk mengamplifikasi fragmen DNA panjang (lebih besar dari tiga kilo basa) memerlukan beberapa kondisi khusus, di antaranya adalah diperlukan polimerase DNA dengan aktivitas yang kuat dan juga buffer PCR dengan pH dan kapasitas tinggi (High-salt buffer).

OPTIMASI PCR

Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses PCR. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seperti jenis polimerase DNA; suhu; konsentrasi, dalam hal ini berkaitan dengan dNTPs, MgCl2 dan DNA polimerase; buffer PCR dan waktu.

1. Jenis polimerase DNA

Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses PCR yang terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda dengan untuk DNA rantai pendek. Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung pada panjang DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari tiga kilobasa akan memerlukan jenis polimerase dengan aktivitas tinggi.

2. Konsentrasi dNTPs, MgCl2; polimerase DNA

Konsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang diamplifikasi. Untuk panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya digunakan konsentrasi dNTPs sebanyak 100 uM, sedangkan untuk panjang target DNA lebih besar dari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPs sebanyak 200 uM.

Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 – 1,5 mM. Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk non target yang disebabkan oleh terjadinya mispriming. Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan 1,25 – 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 – unit per 50 uL campuran reaksi.

3. Suhu

Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara 93 – 95oC, ini semua tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94oC. Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 – 60oC.

Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm– 5)oC sampai dengan (Tm + 5)oC. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen. Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72oC karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR.

4. Buffer PCR

Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer nya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu “Low-salt buffer” (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan “High-salt buffer” (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai dengan jenis polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 – 5 kilobasa biasanya diperlukan “low-salt buffer” sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa digunakan “high-salt buffer”.

5. Waktu

Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi DNA templat umumnya dilakukan selama 30 – 90 detik, ini semua tergantung pada DNA templat yang digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses denaturasi tidak sempurna.

Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer. Untuk panjang primer 18 – 22 basa cukup dengan 30 detik, sedangkan untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu annealing 60 detik.

Pemilihan waktu ekstensi primer tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Secara umum untuk mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA diperlukan waktu 30 – 60 detik. Pada setiap melakukan PCR harus dilakukan juga kontrol positif, ini diperlukan untuk memudahkan pemecahan masalah apabila terjadi hal yang tidak diinginkan. Selain itu juga harus dilakukan terhadap kontrol negatif untuk menghindari kesalahan positif semu.

BAB III
METODOLOGI

1.1 ALAT, BAHAN, DAN FUNGSI

1.1.1 Alat

Mortar & pestle : untuk menghaluskan bahan
gelas ukur : untuk mengukur larutan yang akan digunakan
Tabung eppendorf : sebagai tempat untuk bahan yg diuji
tissue : untuk membersihkan
gunting : untuk menggunting bahan yang akan digunakan
mikropipet : untuk mengambil larutan dalam jumlah yang kecil
spatula : sebagai alat untuk mencampur bahan
erlenmeyer : tabung untuk wadah bahan yang diuji
microwave : sebagai alat untuk pensterilan
mesin vortex : sebagai alat untuk menghomogenkan bahan
timbangan analitik : sebagai alat untuk menimbang bahan
stirer : sebagai alat untuk mencampurkan bahan
pH meter : untuk mengukur pH
mesin centrifuge : untuk mengetahui perbedaan lapisan antara supernatan dan lapisan lainnya
autoclave : untuk pensterilan bahan
freezer : untuk penginkubasian larutan

Bahan

Buffer ekstraksi CTAB dan Merkaptoethanol : untuk melisis membran sel daun
nitrogen cair : untuk mempermudah penggerusan
PVP (polyvinilpirolidone) : untuk melindungi agar DNA tidak rusak
CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) : untuk mendegradasi protein
buffer pencuci : sebagai larutan penyangga
buffer TE
RNAse : sebagai enzim dalam isolasi DNA
Isopropanol : untuk resipitasi
Daun srikaya : sebagai bahan yang diuji

1.2 CARA KERJA

+ buffer ekstrasi timbang sample 0,3

CTAB (1 ml) gr + PVP 1 % + N₂-196 ºC

+ β mercaptoetanol 5 μl

+ inkubasi 30’ 65 ºC

+ chisam 500 μl

Di vortex

sentrifuge 10000 rpm 10’

Ambil supernatan

+ chisam 1 x volume supernatan

Sentrifuge 10000 rpm 10’

+ isopropanol 0,45 x volume supernatan

invert

Inkubasi freezer 30’

Sentrifuge 10000 rpm 10’

Buang isopropanol

DNA pellet

+ buffer pencuci 200 μl 2x

+ RNAse 1 μl

+ resuspensi dengan elution buffer 20-50 μl

Simpan untuk elektroforesis

1.3 ANALISA PERLAKUAN

Pada praktikum isolasi DNA ini bahan yang digunakan adalah daun srikaya. Langkah pertama yang dilakukan adalah mengisi tabung eppendorf dengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris -HCl 0,1M) dan 5 µl mercaptoethanol. Daun srikaya ditimbang 0,3 gram dan digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 1%, kemudian dimasukkan kedalam tabung eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 µl mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65 ^oC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 500 µl chisam (Chloroform : Isoamylalcohol (24:1)). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Dan diambil supernatannya. Supernatan dimasukkan pada mikrovivet baru dan ditambahkan chisam 1 x volume supernatan. Larutan supernatan dan chisam disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol 0,45 x volume supernatan. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 μl buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 20-50 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl RNAse dan disimpan dalam lemari es untuk elektroforesis.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.ANALISA GAMBAR HASIL ELEKTROFORESIS

Gambar Hasil Elektroforesis Warna

Gambar Hasil Elektroforesis Hitam Putih

Dari hasil praktikum mengenai isolasi DNA halus, didapatkan gambar seperti diatas dapat diketahui bahwa penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat adanya potongan pita-pita DNA yang mempunyai fragmen-fragmen. Pada daun srikaya dapat diketahui bahwa salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi, sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.

Dari setiap bahan yang dilakukan untuk praktikum ini tidak semua akan muncul pita DNA saat dielektroforesis. Hal ini dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum dan kesterilan alat dan bahan praktikum. Hal ini menyebabkan tidak munculnya pita DNA saat dielektroforesis dibawah lampu UV.

Pada elektroforesis tersebut terdapat bermacam-macam kontaminasi, diantaranya smear (semburan) yang diakibatkan karena adanya kontaminasi protein dan DNA terdegradasi, berapi-api yang disebabkan karena adanya kontaminasi polisakarida, dan pita tebal dibawah bagian bawah gel agarose yang disebabkan karena adanya kontaminasi RNA. (Asris, 2010)

Dari gambar hasil elektroforesis ini dapat diketahui bahwa adanya kontaminasi polisakarida dengan ditunjukkan adanya gambar berapi-api diatas pita DNA yang sangat tebal.

4.2.KESIMPULAN

Dari praktikum isolasi DNA ini dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari sel dan kotoran. Dari hasil sentrifuge pertama dihasilkan 3 lapisan yaitu lapisan supernatan, lapisan organik, dan lapisan fenol. Dan pada sentrifuge kedua dihasilkan 2 lapisan, yaitu lapisan DNA pellet dan lapisan supernatan. DNA pellet ini lah yang nantinya akan diuji kualitas DNAnya yang sering disebut dengan elektroforesis.

4.3.SARAN

Hasil elektroforesis belum dijelaskan oleh asisten mengenai gambar dan cara analisisnya, untuk lebih jelasnya mohon dijelaskan lagi.

DAFTAR PUSTAKA

Asris. 2010. Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/ 2010/06/19/isolasi-dna/. Diakses tanggal 25 November 2012

Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman

Dengan Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya, Malang.

Larasati, P. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. http://puspalarasati.wordpress.com. Diakses tanggal 2 Desember 2012.

Riyadi, W. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV dan IR). http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September 2011.

Riyadi, W. 2009. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September 2011.

Wanibesak, E. 2011. Spektrofotometri Sinar tampak (Visible). http://wanibesak.wordpress.com. Diakses tanggal 22 September 2011.

burhansetiabudi

4 out of 5 dentists recommend this WordPress.com site

Monthly Archives: Januari 2013

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR EMBRIO

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR EMBRIO

LAPORAN ISOLASI DNA KASAR

LAPORAN ISOLASI DNA HALUS