LAPORAN ISOLASI DNA HALUS

LAPORAN PRAKTIKUM
BIOTEKNOLOGI
“ISOLASI DNA”

Oleh     :

Nama               : Burhan Setia Budi
NIM                 : 115040200111052
Kelompok        : Kamis, 09.15 WIB
Asisten             : M. Arif

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  LATAR BELAKANG

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNAmitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskansifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisansifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuahsel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruhsistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimilikisuatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah.Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimanaterdapat DNA didalamnya.

1.2  TUJUAN

  • Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR
  • Untuk mengetahui uji kualitas DNA
  • Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR
  • Untuk mengetahui manfaat PCR

1.3

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 PENGERTIAN ISOLASI DNA DAN PCR

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Definisi PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip kerjanya memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis.Teknik PCR telah dikembangan untuk diagnosis berbagai penyakit infeksi,seperti Hepatitis, HIV, Human Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M. Tuberculosis.

2.2 UJI KUALITAS DNA

Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri.

Spektrofotometri merupakan suatu  metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009).

Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain :

1. Spektrofotometri Vis (Visible)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang  cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua  cahaya yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visible).

Sumber  cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.Alat ini bekerja berdasarkan hukum Lambert-beer.“Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan ketebalan sel (b), konsentrasi analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu spesi (senyawa) pada suatu panjang gelombang”Logika prinsip dari alat  spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang  diserap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang diserap.Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.

Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil (Riyadi, 2009).

Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna (chromogenik reagent) :

1.    Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.

2.   Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.

3.  Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.

4.  Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran.

5.    Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.

6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehendaki tidak sempurna.

7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.

Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini :

1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.

2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya (ε) besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi.

3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.

4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.

5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.(Wanibesak, E. 2011)

Gb 1. Spektrofotometer Visible tipe spectronic-20 lama yang sudah jarang bahkan mungkin tidak diproduksi lagi

Gb 2. Spektrofotometer Visible tipe Spectronic-20 terbaru.

Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :

[DNA] = Å260 x 50 x Faktor pengenceran

Keterangan :

Å260 =  nilai absorbansi pada  260 nm

50     =  larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug  untai ganda DNA per ml (dsDNA)

[RNA] = Å260 x 40 x Faktor pengenceran

Keterangan :

40=  40 ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA)  (Fatchiyah, 2011).

2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible)

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuatberwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi.

Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2011).

DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada  280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi  260 nm dibagi dengan nilai absorbansi  280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011). Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Larasati, 2011).

Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri UV-Vis antara lain : mikropipet, kuvet,  nanodrop  spektrofotometer dan seperangkat komputer. Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan aquadest sebagai blanko. Cara kerja pengujian kuantitatif DNA diawali dengan menghidukan alat nanodrop spektrofotometer. Kemudian melakukan uji blanko menggunakan aquadest. Setelah itu dilanjutkan dengan menguji isolat DNA dengan cara meneteskannya  pada tempat sampel sebanyak 1 mikroliter. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan baca hasil kemurnian DNA-nya.

Gb. Nanodrop Spektrofotometer

2.3 KOMPONEN DAN TAHAPAN PCR

Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan proses PCR dapat dilihat pada gambar 1.

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier seperti tampak pada bagan di atas (Newton and Graham, 1994).

Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada akhir siklus PCR dapat dihitung secara teoritis menurut rumus:

Gambar 1. Bagan Proses Polymerase Chain Reaction

Y = (2n – 2n)X

Y : jumlah amplicon

n : jumlah siklus

X : jumlah molekul DNA templat semula

Jika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka jumlah amplicon yang diperoleh pada akhir proses PCR adalah 1.074 x 109. Dari fenomena ini dapat terlihat bahwa dengan menggunakan teknik PCR dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen DNA yang diinginkan (amplicon) secara eksponensial dalam waktu relatif singkat. Umumnya jumlah siklus yang digunakan pada proses PCR adalah 30 siklus. Penggunaan jumlah siklus lebih dari 30 siklus tidak akan meningkatkan jumlah amplicon secara bermakna dan memungkinkan peningkatan jumlah produk yang non-target. Perlu diingat bahwa di dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidak terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target templat terlampau banyak, jumlah polimerase DNA terbatas dan kemungkinan terjadinya reannealing untai target.

PELAKSANAAN PCR

Untuk melakukan proses PCR diperlukan komponen-komponen seperti yang telah disebutkan di atas. Pada bagian ini akan dijelaskan secara rinci kegunaan dari masing-masing komponen tersebut.

1. Templat DNA

Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa 2 1 Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan eksperimen.

Pembuatan DNA templat dengan menggunakan metode lisis dapat digunakan secara umum, dan metode ini merupakan cara yang cepat dan sederhana untuk pendedahan DNA kromosom ataupun DNA plasmid. Prinsip metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis. Komposisi buffer lisis yang digunakan tergantung dari jenis sampel. Beberapa contoh buffer lisis yang biasa digunakan mempunyai komposisi sebagai berikut: 5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis ini umumnya digunakan untuk jenis sampel yang berasal dari biakan, sel-sel epitel dan sel akar rambut.

Contoh lain dari buffer lisis adalah buffer lisis K yang mempunyai komposisi sebagai berikut: buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2); 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis K ini biasanya digunakan untuk melisis sampel yang berasal dari sel darah dan virus. Selain dengan cara lisis, penyiapan DNA templat dapat dilakukan dengan cara mengisolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid menurut metode standar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA tersebut diisolasi.

Metode isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan tahapan yang lebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA dengan menggunakan metode lisis. Prinsip isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid adalah pemecahan dinding sel, yang diikuti dengan pemisahan DNA kromosom / DNA plamid dari komponen-komponen lain. Dengan demikian akan diperoleh kualitas DNA yang lebih baik dan murni.

2. Primer

Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. Dalam melakukan perancangan primer harus dipenuhi kriteria-kriteria sebagai berikut:

a. Panjang primer

Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih. Umumnya panjang primer berkisar antara 18 – 30 basa. Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer di tempat lain yang tidak diinginkan) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna dan ini akan menyebabkan lebih mahal.

b. Komposisi primer.

Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya. Rentetan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitas primer yang dapat memungkinkan terjadinya mispriming di tempat lain. Kandungan (G+C)) (% jumlah G dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR. Selain itu, urutan nukleotitda pada ujung 3’ sebaiknya G atau C. Nukleotida A atau T lebih toleran terhadap mismatch dari pada G atau C, dengan demikian akan dapat menurunkan spesifisitas primer.

c. Melting temperature (Tm)

Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer akan berpengaruh sekali di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Secara teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) + 4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 – 65 oC.

d. Interaksi primer-prime

Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari. Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang tidak dikehendaki, ini semua dapat menyebabkan spesifisitas primer menjadi rendah dan di samping itu konsentrasi primer yang digunakan menjadi berkurang selama proses karena terjadinya mispriming. Keadaan ini akan berpengaruh pada efisiensi proses PCR.

3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)

dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan.

4. Buffer PCR dan MgCl2

Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara).

Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan.

5. Enzim Polimerase DNA

Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi . Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai.

Dengan menggunakan teknik PCR, panjang fragmen DNA yang dapat diamplifikasi mencapai 35 kilo basa. Amplifikasi fragmen DNA pendek (kurang dari tiga kilo basa) relatif lebih mudah dilakukan. Untuk mengamplifikasi fragmen DNA panjang (lebih besar dari tiga kilo basa) memerlukan beberapa kondisi khusus, di antaranya adalah diperlukan polimerase DNA dengan aktivitas yang kuat dan juga buffer PCR dengan pH dan kapasitas tinggi (High-salt buffer).

OPTIMASI PCR

Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses PCR. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seperti jenis polimerase DNA; suhu; konsentrasi, dalam hal ini berkaitan dengan dNTPs, MgCl2 dan DNA polimerase; buffer PCR dan waktu.

1. Jenis polimerase DNA

Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses PCR yang terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda dengan untuk DNA rantai pendek. Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung pada panjang DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari tiga kilobasa akan memerlukan jenis polimerase dengan aktivitas tinggi.

2. Konsentrasi dNTPs, MgCl2; polimerase DNA

Konsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang diamplifikasi. Untuk panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya digunakan konsentrasi dNTPs sebanyak 100 uM, sedangkan untuk panjang target DNA lebih besar dari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPs sebanyak 200 uM.

Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 – 1,5 mM. Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Sedangkan konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk non target yang disebabkan oleh terjadinya mispriming. Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan 1,25 – 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 – unit per 50 uL campuran reaksi.

3. Suhu

Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA templat berkisar antara 93 – 95oC, ini semua tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94oC. Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 – 60oC.

Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm– 5)oC sampai dengan (Tm + 5)oC. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen. Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72oC karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR.

4. Buffer PCR

Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer nya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu “Low-salt buffer” (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan “High-salt buffer” (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai dengan jenis polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 – 5 kilobasa biasanya diperlukan “low-salt buffer” sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa digunakan “high-salt buffer”.

5. Waktu

Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi DNA templat umumnya dilakukan selama 30 – 90 detik, ini semua tergantung pada DNA templat yang digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses denaturasi tidak sempurna.

Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer. Untuk panjang primer 18 – 22 basa cukup dengan 30 detik, sedangkan untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu annealing 60 detik.

Pemilihan waktu ekstensi primer tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Secara umum untuk mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA diperlukan waktu 30 – 60 detik. Pada setiap melakukan PCR harus dilakukan juga kontrol positif, ini diperlukan untuk memudahkan pemecahan masalah apabila terjadi hal yang tidak diinginkan. Selain itu juga harus dilakukan terhadap kontrol negatif untuk menghindari kesalahan positif semu.

BAB III
METODOLOGI

1.1  ALAT, BAHAN, DAN FUNGSI

1.1.1   Alat

  • Mortar & pestle     : untuk menghaluskan bahan
  • gelas ukur             : untuk mengukur larutan yang akan digunakan
  • Tabung eppendorf            : sebagai tempat untuk bahan yg diuji
  • tissue                    : untuk membersihkan
  • gunting                  : untuk menggunting bahan yang akan digunakan
  • mikropipet                        : untuk mengambil larutan dalam jumlah yang kecil
  • spatula                  : sebagai alat untuk mencampur bahan
  • erlenmeyer                        : tabung untuk wadah bahan yang diuji
  • microwave                        : sebagai alat untuk pensterilan
  • mesin vortex         : sebagai alat untuk menghomogenkan bahan
  • timbangan analitik : sebagai alat untuk menimbang bahan
  • stirer                     : sebagai alat untuk mencampurkan bahan
  • pH meter               : untuk mengukur pH
  • mesin centrifuge   : untuk mengetahui perbedaan lapisan antara supernatan dan lapisan lainnya
  • autoclave              : untuk pensterilan bahan
  • freezer                  : untuk penginkubasian larutan

 

Bahan

  • Buffer ekstraksi CTAB dan Merkaptoethanol : untuk melisis membran sel daun
  • nitrogen cair          : untuk mempermudah penggerusan
  • PVP (polyvinilpirolidone)             : untuk melindungi agar DNA tidak rusak
  • CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) : untuk mendegradasi protein
  • buffer pencuci      : sebagai larutan penyangga
  • buffer TE
  • RNAse                  : sebagai enzim dalam isolasi DNA
  • Isopropanol          : untuk resipitasi
  • Daun srikaya        : sebagai bahan yang diuji

1.2  CARA KERJA

 

+ buffer ekstrasi                           timbang sample 0,3

CTAB (1 ml)                                 gr + PVP 1 % + N2 -196 ºC

+ β mercaptoetanol 5 μl

+ inkubasi 30’ 65 ºC

+ chisam 500 μl

Di vortex

sentrifuge 10000 rpm 10’

Ambil supernatan

+ chisam 1 x volume supernatan

Sentrifuge 10000 rpm 10’

+ isopropanol 0,45 x volume supernatan

    invert

Inkubasi freezer 30’

Sentrifuge 10000 rpm 10’

                                                       Buang isopropanol

DNA pellet

+ buffer pencuci 200 μl 2x

+ RNAse 1 μl

+ resuspensi dengan elution buffer 20-50 μl

Simpan untuk elektroforesis

1.3  ANALISA PERLAKUAN

Pada praktikum isolasi DNA ini bahan yang digunakan adalah daun srikaya. Langkah pertama yang dilakukan adalah mengisi tabung eppendorf dengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris -HCl 0,1M) dan 5 µl  mercaptoethanol. Daun srikaya ditimbang 0,3 gram dan digerus  dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 1%, kemudian dimasukkan kedalam tabung eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB  dan 5 µl mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun diinkubasi dalam  suhu 65 oC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 500 µl chisam (Chloroform : Isoamylalcohol (24:1)). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm.  Dan diambil supernatannya. Supernatan dimasukkan pada mikrovivet baru dan ditambahkan chisam 1 x volume supernatan. Larutan supernatan dan chisam disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol 0,45 x volume supernatan. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 μl buffer pencuci ke dalam tube,  kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 20-50 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl RNAse dan disimpan dalam lemari es untuk elektroforesis.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.ANALISA GAMBAR HASIL ELEKTROFORESIS

Gambar Hasil Elektroforesis Warna

Gambar Hasil Elektroforesis Hitam Putih

Dari hasil praktikum mengenai isolasi DNA halus, didapatkan gambar seperti  diatas dapat diketahui bahwa penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat adanya potongan pita-pita DNA yang mempunyai fragmen-fragmen. Pada daun srikaya dapat diketahui bahwa salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi, sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.

Dari setiap bahan yang dilakukan untuk praktikum ini tidak semua akan muncul pita DNA saat dielektroforesis. Hal ini dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum dan kesterilan alat dan bahan praktikum. Hal ini menyebabkan tidak munculnya pita DNA saat dielektroforesis dibawah lampu UV.

Pada elektroforesis tersebut terdapat bermacam-macam kontaminasi, diantaranya smear (semburan) yang diakibatkan karena adanya kontaminasi protein dan DNA terdegradasi, berapi-api yang disebabkan karena adanya kontaminasi polisakarida, dan pita tebal dibawah bagian bawah gel agarose yang disebabkan karena adanya kontaminasi RNA. (Asris, 2010)

Dari gambar hasil elektroforesis ini dapat diketahui bahwa adanya kontaminasi polisakarida dengan ditunjukkan adanya gambar berapi-api diatas pita DNA yang sangat tebal.

 

4.2.KESIMPULAN

Dari praktikum isolasi DNA ini dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari sel dan kotoran. Dari hasil sentrifuge pertama dihasilkan 3 lapisan yaitu lapisan supernatan, lapisan organik, dan lapisan fenol. Dan pada sentrifuge kedua dihasilkan 2 lapisan, yaitu lapisan DNA pellet dan lapisan supernatan. DNA pellet ini lah yang nantinya akan diuji kualitas DNAnya yang sering disebut dengan elektroforesis.

4.3.SARAN

Hasil elektroforesis belum dijelaskan oleh asisten mengenai gambar dan cara analisisnya, untuk lebih jelasnya mohon dijelaskan lagi.

DAFTAR PUSTAKA

Asris. 2010. Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/ 2010/06/19/isolasi-dna/. Diakses tanggal 25 November 2012

Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman

Dengan Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya, Malang.

Larasati, P.  2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. http://puspalarasati.wordpress.com. Diakses tanggal 2 Desember 2012.

Riyadi, W. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV dan IR).  http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September 2011.

Riyadi, W. 2009. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September 2011.

Wanibesak, E. 2011. Spektrofotometri Sinar tampak (Visible). http://wanibesak.wordpress.com. Diakses tanggal 22 September 2011.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s